Конфокальная микроскопия

Описание методики

Лазерная конфокальная сканирующая микроскопия (ЛКСМ) — метод оптической микроскопии, обеспечивающий получение изображений с высоким пространственным разрешением за счёт устранения света, исходящего из нефокальных плоскостей. Точечная диафрагма (пинхол) в оптическом тракте отсекает рассеянный свет, позволяя формировать оптические срезы образца на заданной глубине. Последовательное сканирование лазерным лучом и регистрация сигнала флуоресценции точка за точкой дают возможность получать изображения с дифракционным разрешением.

Мультифотонная (двухфотонная) микроскопия расширяет возможности конфокального метода за счёт использования импульсного инфракрасного лазера: два фотона с низкой энергией одновременно поглощаются флуорофором, вызывая возбуждение, эквивалентное одному фотону с удвоенной энергией. Поскольку ИК-излучение значительно меньше рассеивается в биологических тканях, мультифотонный режим позволяет визуализировать структуры на глубине до 400 мкм при сниженной фототоксичности.

Основные возможности метода

• Визуализация живых и фиксированных клеток и тканей с высоким пространственным разрешением
• Многопараметрическое картирование распределения флуоресцентно-меченных молекул по координатам x, y, z, по времени, длинам волн возбуждения и эмиссии, времени жизни флуоресценции (FLIM) и анизотропии флуоресценции
• Регистрация динамических процессов в реальном времени с использованием скоростного резонансного сканера
• Количественные измерения методами флуоресцентной корреляционной и кросс-корреляционной спектроскопии (FCS, FCCS): определение концентрации, коэффициентов диффузии, кинетики молекулярных взаимодействий
• Анализ конформационных изменений молекул и межмолекулярных взаимодействий методом FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции)
• 3D-реконструкция образцов на основе серий оптических срезов

Области применения

• Клеточная и молекулярная биология
• Нейробиология
• Физиология
• Гистология и патоморфология
• Иммунология
• Фармакология и токсикология
• Биология развития
• Исследования живых тканей ex vivo и in vitro